Dosage plasmatique d’un des médicaments antiépileptiques les plus utilisés à l’Hôpital Central de Yaoundé par la méthode HPLC-UV : Choix, développement et validation de la méthode

Edmond Elisée Tsafack
Pharmaco-toxicologie, Université de Yaoundé 1
June, 2016
 

Abstract

Introduction
L’épilepsie est une pathologie neurologique chronique caractérisée par une répétition
généralement spontanée de crises convulsives. C’est la deuxième pathologie neurologique la
plus rependue après les céphalées. L’OMS estime à au moins 50 millions les malades dans le
monde, dont 80% vivent dans les pays à revenus faibles ou intermédiaires. La prévalence
moyenne en Afrique subsaharienne est estimée à 15‰. La prise de médicaments est
largement utilisée pour obtenir la disparition ou tout au moins la diminution de la fréquence
des crises. Cette pharmacothérapie peu parfois nécessiter un Therapeutic Drug
Monitoring ou Suivi Thérapeutique Pharmacologique, spécialement en cas de persistance de
crises ou d’effets indésirables marqués en relation avec la thérapeutique. Le dosage des
médicaments antiépileptiques dans le sang est un outil très indispensable à la réalisation de
ce monitoring. L’objectif général de ce travail était de mettre au point une méthode de dosage
plasmatique d’un des médicaments antiépileptiques les plus prescrits à l’Hôpital Central de
Yaoundé. Plus spécifiquement, il était question de Choisir l’un des antiépileptiques les plus
prescrits par les neurologues de l’Hôpital Central de Yaoundé; de développer une méthode de
dosage plasmatique de celui-ci par Chromatographie liquide haute performance couplée à un
détecteur ultraviolet (CLHP-UV); de la valider suivant les recommandations de la Food and
Drug Administration et de la tester chez quelques patients.
Méthodologie :
Nous avons réalisé une étude descriptive visant à choisir un des principaux
antiépileptiques prescrits par les neurologues et résidents en neurologie de l’Hôpital Central
de Yaoundé ; et une étude expérimentale consistant au développement d’une technique de
dosage de celui-ci par chromatographie liquide haute performance couplée à un détecteur
ultraviolet, sa validation selon des critères de la Food and Drug Administration et son
application sur du plasma de quelques patients. Pour le développement, deux techniques de
prétraitement de l’échantillon ont été testées, diverses conditions chromatographiques ont été
testées afin de choisir celles qui nous permettaient d’atteindre au mieux nos objectifs
analytiques. L’étude s’est étendue sur 8 mois, de Novembre 2015 à Juin 2016.
Résultats
Huit (8) prescripteurs ont été interrogés en tout, dont deux (2) neurologues, trois (3) résidents
de 3ième année neurologie, deux (2) de 2ième année et un (1) résident de neurochirurgie 2ième
année. Sur les huit (8), quatre (4) estimaient que l’antiépileptique qu’ils prescrivent le plus est
le phénobarbital, deux (2) estimaient que c’est le valproate de sodium et les deux (2) autres la
carbamazepine. Sur les huit (8), quatre (4) désiraient que la méthode soit développée
prioritairement pour le phénobarbital, trois (3) pour la carbamazepine et un (1) pour l’acide
valproïque. Pour le développement de la méthode, le temps de rétention du phénobarbital
dissout dans du méthanol pur était de 4,9 min et 6min environ dans le plasma. Ici les
conditions chromatographiques étaient : volume d’injection 10µL ; phase mobile
méthanol/eau 25/75 v/v ; débit de 1mL/min ; colonne reverse phase C18 110A 150mm x 4.6
mm 5microns ; détection ultraviolet 210nm. En modifiant les proportions des solvants de la
phase mobile, l’on a obtenu un temps de rétention du phénobarbital à 6. 3 min pour 40/60
méthanol/eau et le pic du phénobarbital paraissait plus étroit ; un temps de rétention supérieur
à 10 min a été obtenu pour 15/85 méthanol/eau. Deux techniques de prétraitement ont été
testées, la précipitation des protéines plasmatiques par le méthanol avec un ratio de 1 : 4
(plasma : méthanol) qui donnait un pic de phénobarbital à t=6,2 min et la précipitation des
protéines par le méthanol/acide acétique avec un ratio 1:1 qui donnait un pic de phénobarbital
à t=10 min. Dans les deux cas, la phase mobile était méthanol/eau 40/60. La sélectivité de la
méthode a été évaluée avec le plasma de 6 sujets sains et aucun pic n’a été identifié proche du
temps de rétention du phénobarbital.
Conclusion :
Cette étude a révélé que, un des antiépileptiques les plus prescrits au service de Neurologie de
l’hôpital Central de Yaoundé est le phénobarbital. Pour le développement de la méthode de
dosage, la détection du phénobarbital peut être réalisée dans le plasma en utilisant la
technique de précipitation du plasma par le méthanol pur au ratio 1 : 4 pour une précipitation
maximal, suivi d’une filtration sur filtre à micro pores 0,45µm et en injectant dans une HPLC-
UV aux conditions chromatographiques ci-après : volume d’injection 10µL ; phase mobile
méthanol/eau 40/60 ; débit 1mL/min ; colonne reverse phase C18 11OA 150 mm x 4.6 mm
5µm ; détection ultraviolet 210 nm. La sélectivité de la méthode a été évaluée, mais pas la
précision, l’exactitude, les limites de quantification et la calibration de la méthode.
Mots clés : Epilepsie, MAE, phénobarbital, ultraviolet, CLHP-UV
ABSTRACT
Introduction
Epilepsy is a chronic neurological condition characterized by generally spontaneous
recurrence of seizures. It is the second most frequent neurological condition after headache.
WHO estimates at, not less than 50 million, the number patients worldwide, 80% of which
live in countries with low or middle income. The average prevalence in sub-Saharan Africa is
estimated at 15 ‰. Medication is widely used to eradicate or at least reduce the seizures’
frequency. These drugs can sometimes require a Therapeutic Drug Monitoring, especially in
case of persistent attacks or marked adverse effects related to the therapy. The titration of
antiepileptic drugs in blood is a very essential tool for achieving this monitoring. Our main
goal was to develop a method of plasma titration of one of the most prescribed antiepileptic
drugs in the Yaoundé Central Hospital. More specifically, we aimed at finding out which
antiepileptic drug was more frequently prescribed by neurologists in the Yaoundé Central
Hospital; developing a method of plasma assay by HPLC-UV; validating the method
according to the Food and Drug Administration recommendations and finally, testing this
method on some patients.
Methodology
We first conducted a descriptive study to choose the most prescribed antiepileptic in the
Yaoundé Central Hospital; followed by an experimental study consisting of the development
of an assay technique by High Performance Liquid Chromatography coupled with an UV
detector (HPLC-UV), its validation according to the FDA criteria and its application on the
plasma of some patients. For the development, two techniques of pre-treatment of the sample
and various chromatographic conditions were tested in order to select those that enable us to
best achieve our analytical objectives. The study lasted 8 months, from November 2015 to
June 2016.
Results
Eight (8) prescribers were surveyed: Tow (2) neurologists, three (3) 3
rd year and tow (2) 2
nd
year neurology residents, one (1) 2
nd year neurosurgery resident. Among the height (8)
participants, four (4) admitted that the anti-epileptic drug they prescribed most was
phenobarbital, tow (2) felt it was sodium valproate and the remaining two (2) carbamazepine.
Four (4) prescribers out of the eight (8) surveyed wanted the method to be developed
primarily for phenobarbital, carbamazepine was chosen by three and valproic acid had the
remaining vote. For the development of the method, the retention time of Phenobarbital
dissolved in pure methanol was 4.9 min and about 6 min in plasma. The chromatographic
conditions here were: injection volume 10 µL, mobile phase methanol/water 25/75 v/v, flow
1mL/min, reverse phase column C18 110A 150mm x 4.6 mm 5microns, Ultraviolet Detection
210nm. By changing the proportions of solvents in the mobile phase, we obtained a
phenobarbital retention time of 6.3 min at 40/60 methanol/water, the peak of phenobarbital
seemed narrower; a retention time greater than 10 min was obtained for 15/85
methanol/water. Two techniques of pre-treatment were tested, the precipitation of plasma
proteins by methanol with a ratio of 1:4 (plasma:methanol) which gave a phenobarbital peak
at t = 6.2 min and the precipitation of proteins by methanol/acetic acid with a ratio of 1:1
which gave a phenobarbital peak at t = 10 min. in both cases, the mobile phase was
methanol/water 40/60. The selectivity of the method was evaluated with the plasma of 6
healthy subjects and no peak was identified near the phenobarbital retention time.
Conclusions:
This study revealed that phenobarbital is one of the most frequently prescribed antiepileptic
drugs in the Yaoundé Central Hospital. In regard to the titration method, the detection of
phenobarbital can be carried out in the plasma using the plasma precipitation technique by
pure methanol at a 1:4 ratio followed by a filtration with a micro filter (0.45 µm) then finally,
injection into the High Performance Liquid Chromatography under the following
chromatographic conditions: mobile phase methanol/water 40/60, rate 1mL/min, reverse
phase column C18 110A 150 mm x 4.6 mm 5microns; UV detection 210 nm. Method
selectivity was evaluated but not precision, accuracy, limits of quantification and calibration.
Keywords: Epilepsy, MAE, phenobarbital, HPLC -UV, DAD.


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